Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología

Academia centenaria

Celina Araujo de Pérez

**Detección del gen mecA en cepas de Staphylococcus aureus aisladas de pacientes atendidos en el Servicio Autónomo Hospital Universitario Antonio Patricio de Alcalá. Cumaná, estado Sucre**

Los porcentajes de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (SAMR) son altos al compararlos con los meticilino sensibles (SAMS), tanto en pacientes hospitalizados como comunitarios. Con el propósito de detectar el gen mecA se estudiaron 46 cepas, aisladas de muestras clínicas de pacientes atendidos en los diferentes servicios médicos del Servicio Autónomo Hospital Universitario Antonio Patricio de Alcalá, Cumaná, estado Sucre. Según las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana, 38 (82,6%) estaban clasificadas como SAMR y 8 (17,4%) como SAMS. Se determinaron la concentración inhibitoria mínima (CIM) a oxacilina y presencia de la proteína fijadora de la penicilina modificada (PBP2a) y la detección del gen mecA, mediante la reacción en cadena de la polimerasa. El 93,5% de las cepas resultó PBP2a positivo, en el 100% se detectó el gen mecA y la CMI50 de oxacilina fue de 32 μg/mL. Se recomienda la implementación de la detección del gen mecA, tanto en cepas de SAMR como SAMS en los laboratorios de microbiología, con lo cual se evitarían resultados errados y, en consecuencia, tratamientos inadecuados en los pacientes.

The percentages of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) are high when compared with methicillin-sensitive (SAMS), both in hospitalized and community patients. With the purpose of detecting the mecA gene, 46 strains were studied, isolated from clinical samples of patients treated in the different medical services of the Autonomous University Hospital Service Antonio Patricio de Alcalá, Cumaná, Sucre State. According to the antimicrobial susceptibility tests, 38 (82.6%) were classified as MRSA and 8 (17.4%) as SAMS. The minimum inhibitory concentration (MIC) to oxacillin and the presence of the modified penicillin binding protein (PBP2a) and the detection of the mecA gene were determined by the polymerase chain reaction. The 93.5% of the strains were PBP2a positive, in 100% the mecA gene was detected and the MIC50 of oxacillin was 32 μg/mL. The implementation in microbiology laboratories of the detection of the mecA gene is recommended, both in strains of SAMR and SAMS, which should avoid erroneous results and, consequently, inadequate treatments in patients.

Investigación de agentes causantes de campilobacteriosis y trichomonosis genital bovina en reproductores puros de origen del sur del estado de Mato Grosso

Este trabalho teve como objetivo pesquisar a presença de Campylobacter fetus e Tritrichomonas foetus em touros usados em monta natural de rebanhos de seleção. Foram coletadas 70 amostras em triplicata, com intervalo de 15 dias, de esmegma de toros reprodutores que estavam em repouso sexual. Para o cultivo de C. fetus o material foi transportado em meio Lander e incubado por 72 horas a 37 °C; após foi inoculado em ágar BHI enriquecido e com suplemento seletivo para Campylobacter e incubado em microaerofilia, a 37 ºC por 72 horas. Para o cultivo de T. foetus, a amostra foi colocada no meio Lactopep e incubada a 37 °C, por 10 dias. Nenhuma amostra apresentou crescimento de T. foetus e/ou C. fetus. Assim, concluiu-se que em rebanhos genéticos elevados as estratégias indicadas para o controle dos patógenos pesquisados acontecem de forma eficaz o que é muito importante para a manutenção da eficiência reprodutiva do rebanho.

Este trabajo tuvo como objetivo investigar la presencia de Campylobacter fetus y Tritrichomonas foetus en toros usados en monta natural de rebaños de selección. Se recogieron 70 muestras de esmegma por triplicado, con intervalos de 15 días, de toros reproductores que estaban en reposo sexual. Para el cultivo de C. fetus, el material fue transportado en medio Lander, incubado por 72 horas a 37 °C; después fue inoculado en agar BHI enriquecido más un suplemento selectivo para Campylobacter e incubado en microaerofilia, a 37 ºC por 72 horas. Para el cultivo de T. foetus, las muestras fueron colocadas en medio Lactopep e incubadas a 37 °C, durante 10 días. Ninguna muestra presentó crecimiento de T. foetus y/o C. fetus. Se concluyó que en rebaños de alta genética las estrategias indicadas para el control de los patógenos investigados funcionaron de forma eficaz, lo que es muy importante para el mantenimiento de la eficiencia reproductiva del rebaño.

The objective of this work was to investigate the presence of Campylobacter fetus and Tritrichomonas fetus in bulls used in natural selection of herds. A total of 70 smegma samples were collected in triplicate, with intervals of 15 days, from breeding bulls that were in sexual rest. For culture of C. fetus the material was transported in Lander medium and incubated for 72 h at 37oC; after inoculation with enriched BHI agar and with a selective supplement for Campylobacter were incubated in microaerophilic cells at 37ºC for 72 hours. For T. fetus culture, samples were placed in Lactopep medium and incubated at 37 °C for 10 days. None of the samples produced growth of T. fetus and/or C. fetus. Thus, it was concluded that in high genetic herds the strategies indicated for the control of the pathogens researched happen to be effective, which is very important for the maintenance of the reproductive efficiency of the herd.

Identificación y propiedades de interés tecnológico de levaduras aisladas de productos lácteos de la región de Santa Fe, Argentina

El objetivo del presente trabajo fue estudiar la microbiota de levaduras típica de quesos producidos en Argentina, así como sus propiedades para degradar los componentes de la leche. Se estudiaron levaduras aisladas de leche cruda, leche-fermentos, suerofermentos, cuajadas y quesos provenientes de la zona productora santafesina (Argentina), que resultaron pertenecer a los géneros Candida, Cryptococcus, Pichia y Brettanomyces. Las propiedades tecnológicas ensayadas fueron actividad lipolítica y proteolítica, y metabolización de aminas, lactosa, ácido láctico y galactosa y aminoácidos. Las levaduras estudiadas presentaron diversos grados de proteólisis y lipólisis y todas asimilaron las aminas ensayadas. La capacidad de metabolización de lactosa, galactosa y ácido láctico fue una característica común en todos los aislados, y la degradación de los aminoácidos estudiados varió de acuerdo con la cepa en estudio. La degradación de grasa y proteínas confiere características típicas a cada variedad de quesos y la capacidad de metabolizar azúcares, ácido láctico, aminas biógenas y aminoácidos juega un papel importante durante su maduración. Se concluyó que es necesario conocer la biota de levaduras participante en la maduración de cada variedad de queso, así como sus propiedades tecnológicas, a fin de preparar fermentos apropiados para mantener su tipicidad.

The objective of the present work was to study the yeast microbiota typical of cheese produced in Argentina, as well as its properties to degrade the components of milk. Yeasts isolated from raw milk, milk-ferments, whey-ferments, curds and cheeses from the Santa Fe producing area (Argentina) were studied, which were found to belong to the genera Candida, Cryptococcus, Pichia and Brettanomyces. The technological properties tested were lipolytic and proteolytic activity, metabolization of amines, lactose, lactic acid and galactose and amino acids. The yeasts studied showed different degrees of proteolysis and lipolysis and all of them assimilated the amines tested. The metabolic capacity of lactose, galactose and lactic acid was a common feature in all isolates, and the degradation of the amino acids studied varied according to the strain under study. The degradation of fat and proteins confers typical characteristics to each variety of cheeses and the ability to metabolize sugars, lactic acid, biogenic amines and amino acids plays an important role during their maturation. It was concluded that it is necessary to know the biota of yeasts participating in the maturation of each variety of cheese, as well as their technological properties, in order to prepare appropriate ferments to maintain their regular characteristics.

**Secreción de enzimas hidrolíticas (DNAsas, lipasas y proteasas) por Cladosporium cladosporioides aislado de suelo y su potencial aplicación en biotecnología**

Os microrganismos habitam todos os tipos de solos e apresentam uma enorme diversidade metabólica o que os faz uma importante fonte de bioprodutos, dentre eles, as enzimas. O objetivo deste trabalho foi isolar pelo menos um microrganismo capaz de secretar as enzimas hidrolíticas lipases, proteases e com ênfase DNAses, a partir de uma amostra de terra de jardim e usá-las como fonte produtora destas enzimas, para a formulação de um detergente. Foi encontrado o fungo filamentoso, denominado inicialmente F6, produtor de tais enzimas. Estudos com os extratos de cada enzima sobre seus substratos (azeite de oliva, caseína e DNA extraído de diferentes organismos) mostraram forte atividade a 30 °C e pH 7,5, e estabilidade quando estocados sob refrigeração a 8 °C por dois meses. O fungo F6 foi identificado como Cladosporium cladosporioides por morfologia observada à microscopia óptica e por sequenciamento da região ITS pelo método de Sanger. A importância deste achado inédito é o fato de obter as enzimas de interesse a partir de um mesmo microrganismo, o que facilita e economizam condições de cultivo, temperatura de incubação e teor de aeração, dentre outros, para desenvolver no futuro um detergente enzimático.

Los microorganismos habitan todos los tipos de suelos y presentan una enorme diversidad metabólica, lo que los hace una fuente importante de bioproductos, entre ellos, las enzimas. El objetivo de este trabajo fue aislar al menos un microorganismo secretor de enzimas hidrolíticas (lipasas, proteasas, con énfasis en ADNasas), a partir de una muestra de tierra de jardín, y usarlo como fuente productora de enzimas para la formulación de un detergente. Se encontró un hongo filamentoso, denominado inicialmente F6, productor de tales enzimas. Los estudios con los extractos de cada enzima sobre sus sustratos (aceite de oliva, caseína y ADN extraído de diferentes organismos) mostraron fuerte actividad a 30 °C y pH 7,5, así como estabilidad cuando se almacenaron bajo refrigeración a 8 °C durante dos meses. El hongo F6 fue identificado como Cladosporium cladosporioides por su morfología en microscopía óptica y por secuenciación de la región ITS por el método de Sanger. La importancia de este hallazgo inédito es el hecho de obtener las enzimas de interés a partir de un mismo microorganismo, lo que facilita y ahorra condiciones de cultivo, temperatura de incubación y contenido de aireación, entre otros, para desarrollar en el futuro un detergente enzimático.

Microorganisms inhabit all types of soils and present an enormous metabolic diversity, which makes them an important source of bioproducts, among them, the enzymes. The objective of this work was to isolate from a sample of garden soil, at least one microorganism able to produce hydrolytic enzymes (lipases, proteases and with emphasis DNAses) and use it as a source of enzymes for the formulation of a detergent. A filamentous fungus was found, initially named F6, which produced such enzymes. Studies with extracts of each enzyme on their substrates (olive oil, casein and DNA extracted from different organisms) showed strong activity at 30 °C and pH 7.5, and stability when stored under refrigeration at 8 °C during two months. The F6 fungus by optical microscopic morphology was identified as Cladosporium cladosporioides and by sequencing the ITS region by the Sanger method. The importance of this unprecedented finding is the fact of obtaining the enzymes of interest from the same microorganism, which facilitates and saves culture conditions, incubation temperature and aeration content, among others, to develop an enzymatic detergent in the future.

Ántrax fatal: primer caso humano documentado en Argentina de meningitis y bacteriemia

El ántrax es una zoonosis causada por Bacillus anthracis. En humanos produce infecciones cutáneas, respiratorias, gastrointestinales y con menor frecuencia meningitis. Se reporta el primer caso en Argentina de meningitis y bacteriemia por B. anthracis. Se trata de un paciente adulto que comenzó con síntomas gripales e inflamación de ganglios axilares. A las 48 h ingresó al hospital con depresión del sistema nervioso central y traumatismo toracoabdominal derecho. La TAC reveló en el hemisferio cerebral izquierdo una masa bien definida. El paciente fue tratado empíricamente con meropenem y vancomicina. Falleció a las 48 h por shock refractario y paro cardiorrespiratorio. En los cultivos de las muestras de sangre y de líquido cefalorraquídeo se obtuvo desarrollo bacteriano el cual no fue posible identificar mediante pruebas bioquímicas. El aislamiento se derivó a centros de referencia donde se confirmó a nivel molecular el agente etiológico: B. anthracis. Este caso destaca la importancia de evaluar, en áreas endémicas, los factores epidemiológicos, ya que la presencia de síntomas gripales y ganglios inflamados en un paciente, puede enmascarar cuadros graves de meningitis y bacteriemia con desenlace fatal.

Anthrax is a zoonosis caused by Bacillus anthracis. In humans produces skin, respiratory, gastrointestinal infections and, less frequently, meningitis. The first case in Argentina of meningitis and bacteremia due to B. anthracis is reported. He was an adult patient who started with flu-like symptons and axillary lymph node inflammation which was treated as outpatient. Forty-eight hours later he was admitted to the hospital with depression of the central nervous system and thoracoabdominal trauma. The CT scan revealed a well defined mass in the left cerebral hemisphere. The patient was treated empirically with meropenem and vancomycin. He died at 48 hours due to refractory shock and cardiorespiratory arrest. Blood and cerebrospinal fluid cultures were positive for bacterial growth, but could not be identified by biochemical tests. Isolates were derived to laboratory reference centers where the etiological agent B. anthracis was confirmed by molecular means. This case highlights the importance of considering epidemiological factors in endemic areas, since the presence of flulike symptoms and swollen lymph nodes in a patient can be announcing a meningitis and a bacteremia with fatal outcome.

**Mucormicosis rinosinusal por Cunninghamella bertholletiae en un paciente con leucemia: A propósito de un caso**

Cunninghamella bertholletiae es un patógeno oportunista inusual, que pertenece al orden de los Mucorales y causa infección en pacientes inmunosuprimidos, particularmente con enfermedades hematológicas malignas. Se reporta un caso de mucormicosis rinosinusal por C. bertholletiae en un paciente con leucemia mieloide aguda. Los factores críticos para el manejo médico óptimo de la mucormicosis son el diagnóstico temprano, la reversión de los factores predisponentes, el desbridamiento quirúrgico y una terapia antifúngica apropiada precoz. Sin embargo, el éxito de la intervención podría verse amenazado por el delicado equilibrio del sistema inmune de los pacientes inmunocomprometidos.

Cunninghamella bertholletiae is an unusual opportunistic pathogen which belongs to the order of the Mucorales and causes infection in immunosuppressed patients, particularly with malignant hematological diseases. We report a case of rhinosinusal mucormycosis caused by C. bertholletiae in a patient with acute myeloid leukemia. The critical factors for optimal medical management of mucormycosis are early diagnosis, reversal of predisposing factors, surgical debridement, and appropriate early antifungal therapy. However, the success of the intervention could be threatened by the delicate balance of the immune system of immunocompromised patients.

**Susceptibilidad a los antibióticos en cepas de Helicobacter pylori aisladas de pacientes venezolanos con ulcera duodenal**

Helicobacter pylori antimicrobial drug resistance has appeared as an important cause of treatment failure. Samples were collected from 38 H. pylori infected patients with duodenal ulcers from the Gastroenterology Service of the Hospital Vargas, Caracas, Venezuela (2009-2011) and were processed by the E-test method. The 94.8% isolates were sensitive to clarithromycin and erythromycin with MIC values of <0.5 mg/L and < 2 mg/L respectively. The 92.2% of the strains had a tetracycline MIC under 1 mg/L and 37% of the sensitive H. pylori strains had a metronidazole MIC of <8 mg/L. Metronidazole resistance occurred in 24/38 strains (63.1%), while resistance to erythromycin was found in 2/38 strains (5.2%), clarithromycin in 2/38 (5.2%), and tetracycline in 3/38 (7.8%) of the isolates. None of the strains was found to be resistant to amoxicillin. We observed 6/38 (15.8%) multi-drug resistance of H. pylori isolates in different combinations.

La resistencia de Helicobacter pylori a los antibióticos es una de las mayores causas de la falla terapéutica. Se usó el método de E-test en 38 cepas de H. pylori aisladas de pacientes con ulceras duodenales provenientes del Servicio de Gastroenterología, Hospital Vargas de Caracas, Venezuela (período 2009-2011). El 94,8% de las cepas fueron sensibles a claritromicina y eritromicina con una CMI de <0,5 mg/L y < 2 mg/L respectivamente. El 92,2% de las cepas fueron sensibles a tetraciclina (<1 mg/L) y 37% de las cepas fueron sensibles a metronidazol con una CMI <8 mg/L. La resistencia a metronidazol ocurrió en 24/38 cepas (63,1%), eritromicina en 2/38 cepas (5,2%), claritromicina en 2/38 (5,2%), tetraciclina en 3/38 (7,8%) de los aislados. No se encontró resistencia a amoxicilina. Se observó 6/38 (15,8%) cepas multirresistentes en distintas combinaciones.

Utilidad del Litmus Milk® para la diferenciación de los complejos de especies Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes

El objetivo de esta investigación fue evaluar la utilidad del medio Litmus Milk® para la diferenciación de los complejos de especies Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes. Se emplearon 52 aislamientos del género Trichophyton, identificados a nivel de género y especie según sus características macro y micromorfológicas en cultivo; adicionalmente se emplearon la prueba de hidrólisis de la urea, así como crecimiento y alcalinización del medio Litmus Milk®. Se identificaron 43 aislados como complejo T. rubrum, los cuales mostraron características morfológicas propias del complejo, crecimiento restringido sin alcalinización del agar Litmus Milk® e hidrólisis de urea negativa. Los nueve aislados restantes se identificaron como complejo T. mentagrophytes y todos mostraron las características morfológicas propias del complejo, crecieron profusamente y alcalinizaron el agar Litmus Milk® e hidrolizaron la urea. El agar Litmus Milk® puede utilizarse como herramienta complementaria para la diferenciación del complejo T. rubrum del complejo T. mentagrophytes.

The aim of this research was to evaluate the use of the Litmus Milk® medium for the differentiation of the Trichophyton rubrum and Trichophyton mentagrophytes species complex. Fifty-two isolates of the genus Trichophyton were used. The identification at genus and species level was made according to their macro and micromorphological characteristics in culture. In addition, the urea hydrolysis as well as the growth and alkalinization of the Litmus Milk® medium were used. Forty-three isolates were identified as T. rubrum complex, which showed the morphological characteristics of the complex, restricted growth without alkalinization of Litmus Milk® agar, and negative urea hydrolysis. The remaining nine isolates were identified as T. mentagrophytes complex, and all showed the morphological characteristics of the complex, grew profusely and alkalinized the Litmus Milk® agar and hydrolyzed urea. Litmus Milk® can be used as a complementary tool for the differentiation of T. rubrum complex from the T. mentagrophytes complex.

Detección del virus Guanarito mediante la técnica de RT-PCR en un solo paso

Se estandarizó una RT-PCR en un solo paso para la detección del virus Guanarito (VGTO), con el propósito de sustituir la técnica de cultivo celular, empleada para el diagnóstico de la fiebre hemorrágica venezolana, y minimizar el riesgo biológico por exposición a este virus. Se diseñaron cebadores específicos para la detección del segmento S del gen de la nucleocápside de VGTO y se estandarizó un protocolo donde se analizaron 44 muestras: 18 sueros agudos, 11 macerados de tejidos y 15 sobrenadantes de cultivos en células Vero-E6 como controles positivos. Los resultados obtenidos por la RT-PCR fueron comparados con la técnica de cultivo celular, encontrándose un 100% de sensibilidad y especificidad, con valores predictivos positivos y negativos de 97,7% y 100%, respectivamente. El coeficiente de correlación de Pearson entre ambas pruebas fue de 99%. Este es el primer reporte del uso de una metodología para el diagnóstico molecular específico del VGTO en Venezuela.

A one-step RT-PCR was standardized for the detection of Guanarito virus (VGTO), with the purpose of replacing the cell culture technique, used for the diagnosis of Venezuelan hemorrhagic fever, and to minimize the biological risk from exposure to this virus. Specific primers were designed for the detection of the S segment of the nucleocapsid gene of VGTO. A protocol was standardized where 44 samples were analyzed: 18 acute sera, 11 macerated tissues and 15 culture supernatants in Vero-E6 cells as positive controls. The results obtained by the RT-PCR were compared with the cell culture technique, finding 100% sensitivity and specificity, with positive and negative predictive values of 97.7% and 100%, respectively. The Pearson correlation coefficient between both tests was 99%. This is the first report of the use of a methodology for the molecular diagnosis specific to VGTO in Venezuela.